劉宗利 王乃強(qiáng) 劉海玉 楊海軍 保齡寶生物股份有限公司
多糖的抗病毒活性與多糖的分子量大小、硫酸根含量以及空間構(gòu)象有較大聯(lián)系，本文對微波輻射制備不同分子量卡拉膠多糖及硫酸酯化修飾技術(shù)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法
1.1 材料
標(biāo)準(zhǔn)多糖（Dextran Standard 270000、80000、12000、5000、1000和DextranBlue），卡拉膠，真空反應(yīng)器，，凝膠色譜柱。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 微波輻射制備卡拉膠多糖
取一定量卡拉膠加水?dāng)噭颍?0℃保溫15min，使其充分溶解；然后加入一定量H2SO4，750W微波處理10～30min；料液先用堿調(diào)節(jié)至pH4.5，冷卻后調(diào)至pH6.0。
1.2.2 硫酸酯化反應(yīng)
（1）原料預(yù)處理。噴霧干燥上述料液，105℃干燥至含水量低于3％，備用。
（2）酯化試劑制備。向5L反應(yīng)器中加入2000mL吡啶，置于冰水浴中充分冷卻，沿反應(yīng)器壁緩慢滴加氯磺酸，充分?jǐn)嚢瑁辊セ瘎┤芙猓纬赏该鞯倪拎せ撬崛芤骸?br />（3）酯化反應(yīng)及終點(diǎn)控制
恒溫條件下，分批加入酯化試劑至卡拉膠樣品，攪拌均勻。反應(yīng)式：吡啶磺酸+卡拉膠多糖→卡拉膠硫酸化多糖+吡啶。

硫酸酯化產(chǎn)物中含大量的無機(jī)鹽和少量的吡啶，采用納濾系統(tǒng)（250Da）進(jìn)行脫鹽和濃縮；濃縮后物料進(jìn)行噴霧干燥。工藝參數(shù)：熱空氣進(jìn)口溫度170～180℃，出口溫度80～95℃，噴頭壓力2kg/cm2。
1.2.3 分子量測定
高效凝膠色譜法測定多糖分子量，色譜柱TSK－GEL G5000 PWXL（7.8mm×30cm），流動相為0.07％Na2SO4溶液、0.4mL/min，柱溫50℃。將各標(biāo)準(zhǔn)多糖配成濃度為10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，各取25uL進(jìn)樣，以出峰時(shí)間和各標(biāo)準(zhǔn)樣分子量的對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制樣品溶液、進(jìn)樣、測定出峰時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子量。

2 結(jié)果與分析
2.1 微波輻射法制備特定分子量卡拉膠多糖條件的確定
利用微波制備特定分子量卡拉膠，具有速度快、操作簡便、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。影響產(chǎn)物的主要因素包括：料液pH、處理時(shí)間、料液濃度、微波功率等。
2.1.1 料液濃度、體積和工作功率的確定
選擇料液體積為600mL/次，料液濃度小于5％時(shí)，料液濃度對微波處理效果的影響不大，過高的濃度引起降解不均勻，產(chǎn)生大量沉淀物。故確定微波750W處理時(shí)的料液濃度為5％。
2.1.2 pH值和時(shí)間對處理效果的影響
設(shè)定處理時(shí)間10min、12min、23min、30min四個(gè)水平，處理pH值2.5、2.0、1.5三個(gè)水平；同時(shí)測定分子量<1000、1000～20000、>20000的產(chǎn)物峰面積。

以上結(jié)果表明，pH值對水解程度的影響十分明顯，pH1.5條件太過劇烈，導(dǎo)致卡拉膠水解過度；pH2.5時(shí)水解程度很低，卡拉膠處于凝固態(tài)；pH2.0條件下進(jìn)行水解，產(chǎn)物分布符合要求。
在pH2.0條件下，取時(shí)間10min、12min、23min、30min制備卡拉膠，產(chǎn)物分布情況見表3。

利用微波輻射酸解法制備特定分子量卡拉膠的條件為：料液濃度5％（w/w），料液體積60mL，pH2.0，750W微波處理10～30min。目標(biāo)產(chǎn)物分子量為1000～3000Da時(shí)，微波處理時(shí)間為30min；5000～8000Da，處理時(shí)間20min；10000～12000Da，處理時(shí)間12min。
2.2 特定硫酸根取代度卡拉膠硫酸多糖制備
考察反應(yīng)溫度對取代度的影響，在酯化劑摩爾比為4∶1條件下，設(shè)置不同反應(yīng)溫度。

從上表可看出，要達(dá)到相同取代度，小分子量卡拉膠需要的反應(yīng)溫度低于大分子量卡拉膠。這可能是由于多糖的分子量越小，其立體結(jié)構(gòu)中暴露在外的游離羥基(-OH)也就越多，還原性也就越強(qiáng)，達(dá)到一定取代度需要的溫度也就越低。小分子量卡拉膠耐受的酯化反應(yīng)溫度較低，反應(yīng)過程中采用梯度升溫策略，更有利于得到均勻且充分酯化的卡拉膠。考察酯化劑比例對取代度的影響時(shí)，不同分子量卡拉膠要設(shè)立不同的反應(yīng)溫度，結(jié)果如表5所示。

結(jié)果表明，酯化劑比例和卡拉膠分子量對硫酸酯化效果的影響很大。取代度隨酯化劑用量的增加而增加；分子量越小，暴露在外能參與酯化反應(yīng)的羥基就越多，越容易被氧化，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)達(dá)到相同取代度所需酯化劑就越少。

3 結(jié)束語
本文開發(fā)了微波輻射法制備特定分子量卡拉膠多糖技術(shù)和硫酸酯化反應(yīng)梯度升溫控制策略，得到特定分子量及硫酸根取代度的卡拉膠多糖，為卡拉膠多糖的抗流感病毒活性研究奠定了基礎(chǔ)。